故事发生在“蜘蛛侠”打败“绿色恶魔”的两年后，彼得8226帕克远离自己挚爱的女友玛丽8226简，继续过着平淡而充满刺激的双重生活，白天他依旧是温文尔雅、有些木讷的大学生，晚上则化身成为拥无限超人力量、除暴安良的蜘蛛侠。不过彼得8226帕克却越来越难以平衡这种双重性格，周围的人开始怀疑他的身份，甚至很多人对其开始猜疑和误解，连一向慈祥的阿姨对他的异常举动也显出一份惊讶和不安……彼得8226帕克一直生活在矛盾中，他希望向玛丽表白自己的爱恋，更希望能够跟她坦诚自己的真实身份。另外，彼得发现好友哈里8226奥斯本对蜘蛛侠杀了他的父亲，一直耿耿于怀，身陷仇恨，不可自拔6奥斯本对蜘蛛侠杀了他的父亲，一直耿耿于怀，身陷仇恨，不可自拔…… 与此同时，一位被称为“章鱼博士”的天才科学家，为了让自己可以在安全距离内研究有辐射的能料，在自己的背后安装了四只长长的机械手，做起实验来方便不少，但是不料一场基因突变实验失败之后，这四只机械手就永久固定在他的背后，盘根错节，眼花缭乱。而那场失败的实验也使得“章鱼博士”的性格变得偏激和疯狂，为了夺取权力和钱财，“章鱼博士”耍出各种手段，让他成为令蜘蛛侠最头疼的敌人。彼得8226帕克为了阻止这位疯狂科学家的恶行，开始了又一场惊心动魄的冒险之旅……

大战绿妖之后，蜘蛛侠帕克（托比•马奎尔 Tobey Maguire 饰）忍痛拒绝了他唯一的挚爱玛丽（克尔斯滕•邓斯特 Kirsten Dunst 饰），因为蜘蛛侠的身份会为自己和亲人带来巨大危险，帕克决定独立承担起蜘蛛侠的责任。帕克一直在忙于应付各种挑战：学习超能力的灵活运用；在超级英雄与平凡大学生的双重身份下隐藏自我、小心翼翼地生活等等。帕克对玛丽越来越难以自拔，但是作为蜘蛛侠又不能对玛丽展开心扉。好友哈利因为误会蜘蛛侠而一直处处与其为作对；唯一的亲人婶婶也对蜘蛛侠的真实身份产生了怀疑。同时，新的挑战又出现了：邪恶而强大的章鱼博士。帕克在种种压力下肩负起蜘蛛侠的使命。

能力越大，责任越大。蜘蛛侠彼得·帕克（安德鲁·加菲尔德 饰）在全力和犯罪、灾难做斗争的同时，终于迎来了毕业的时刻。可是曾经的一段心结，让他和女友格温·史黛西（艾玛·斯通 饰）的关系降至冰点。格温应聘于为全城提供电力的奥斯本集团公司，同一期间发生的两件事，不由得左右这家公司和彼得等人的命运。奥斯本的掌门人病故，他的儿子哈利（戴恩·德哈恩 饰）以20岁的年龄接受这家市值2000亿美元的巨无霸。另一方面，极度崇拜蜘蛛侠的电力工程师迈克斯·狄龙（杰米·福克斯 饰）在维修机组时意外身亡，当他再度醒来时发现自己变成了全身充满电能的超人类。 感到受了欺骗的迈克斯与蜘蛛侠在时代广场展开对决，而彼得和哈利的友情也将遭到命运的戏弄……

在复仇者联盟众英雄的努力下，于灭霸无限手套事件中化作为灰烬的人们，重新回到了人世间，曾经消失的蜘蛛侠 彼得帕克 也回归到了普通的生活之中，数月后，蜘蛛侠彼得帕克所在的学校举行了欧洲旅游，帕克也在其中， 在欧州威尼斯旅行时，一个巨大无比的水怪袭击了威尼斯，不敌敌人的蜘蛛侠幸得一位自称神秘客的男子搭救才击退敌人，之后 神盾局局长找上正在旅游的彼得帕克并要求其加入神盾局，并安排神秘客协助帕克，神秘客自称来自其他宇宙，并告知一群名为元素众的邪恶势力已经入侵这个宇宙了，为了守护来之不易的和平，蜘蛛侠决定与神秘客联手，然而在神秘客那头罩之中，似乎隐藏着什么不为人知的真相……

在复仇者联盟众英雄的努力下，于灭霸无限手套事件中化作为灰烬的人们，重新回到了人世间，曾经消失的蜘蛛侠 彼得帕克 也回归到了普通的生活之中，数月后，蜘蛛侠彼得帕克所在的学校举行了欧洲旅游，帕克也在其中， 在欧州威尼斯旅行时，一个巨大无比的水怪袭击了威尼斯，不敌敌人的蜘蛛侠幸得一位自称神秘客的男子搭救才击退敌人，之后 神盾局局长找上正在旅游的彼得帕克并要求其加入神盾局，并安排神秘客协助帕克，神秘客自称来自其他宇宙，并告知一群名为元素众的邪恶势力已经入侵这个宇宙了，为了守护来之不易的和平，蜘蛛侠决定与神秘客联手，然而在神秘客那头罩之中，似乎隐藏着什么不为人知的真相……